Experimentelle Unfallchirurgie, Klinikum rechts der Isar, München

Der erste Teil des Projekts konzentrierte sich auf den Knochenanteil des Knochen-Band Tissue Engineering Konstruktes. Eine besondere Art Mineralpartikel, nämlich bioaktive Glaspartikel aus kubanischem Sand, wurde hergestellt, um ihren Einfluss auf die Fähigkeit von humanen Zellen, Knochen zu bilden, in vitro untersuchen zu können. Humane Osteoblasten (knochenbildende Zellen) und Stammzellen, die aus Fettgewebe gewonnen werden (AdMSCs), wurden gemeinsam mit den Glaspartikeln für bis zu 35 Tage kultiviert und auf ihre Proliferation und ihre Fähigkeit, eine knochenähnliche extrazelluläre Matrix zu synthetisieren, untersucht. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die bioaktiven Glaspartikel die Reifung und Differenzierung hin zu Osteoblasten sowohl in den Osteoblasten, als auch in den AdMSCs, induzieren. Als nächsten Schritt wurden die bioaktiven Glaspartikel in eine Polymermatrix, bestehend aus Polycaprolacton (PCL), eingebracht, um mittels 3D Druck einen Komposit-Scaffold (Gerüstträger) herzustellen (Abb. 1). PCL wurde deswegen als Werkstoff gewählt, weil es für den klinischen Einsatz geeignet ist (von der U.S. Food and Drug Administration genehmigt) und gute mechanische Eigenschaften aufweist. Die Komposit-Scaffolds wurden entworfen, um der Zusammensetzung von nativem Knochen zu ähneln: eine mineralische Phase (hauptsächlich aus Kalziumphosphat), die in eine Proteinmatrix eingebettet ist (hauptsächlich aus Collagen I). Die Scaffolds wurden hinsichtlich ihrer Biokompatibilität und ihrer osteogenen Eigenschaften mit humanen Osteoblasten und AdMSCs untersucht. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Komposit-Scaffolds die Zellen zur Absonderung einer knochenartigen extrazellulären Matrix induzieren, die aus Collagen I und Kalziumphosphat besteht (Abb. 1). Zusätzlich ergab eine Genexpressionsanalyse, dass Gene, die mit dem osteoblastären Zellphänotyp assoziiert sind, hoch exprimiert waren in Zellen, die auf Komposit-Scaffolds angesiedelt wurden, aber nicht auf den Scaffolds, die nur aus PCL gefertigt worden waren. Interessanterweise zeigten diejenigen AdMSCs, die auf den Komposit-Scaffolds wuchsen, auch eine erhöhte Expression des Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Gens, das für die Induktion der Bildung von Blutgefäßen unerlässlich ist. Die Bildung neuer Gefäße ist von entscheidender Wichtigkeit für die Integration und Versorgung mit Nährstoffen von implantierten Tissue Engineering Konstrukten.

Der zweite Teil des Projekts befasste sich hauptsächlich mit der Herstellung eines integrierten Knochen-Band Konstruktes, der Enthese. Das Material der Wahl war dabei Seidenfibroin, ein natürliches Polymer mit mechanischen Eigenschaften, die denen des nativen Bandes sehr nahe kommen. Die Scaffolds wurden so entworfen, dass sie den schrittweisen Anstieg an parallel ausgerichteten Kollagenmolekülen nachahmen, der beim Übergang von Knochen zum Band existiert. Diese Scaffolds bestehen aus zwei Teilen (Abb. 2), nämlich zufällig verteilte Poren (im Knochenanteil) und parallel ausgerichteten Poren (im Bandanteil). Der Übergang zwischen den beiden Teilen war sauber und gewährte dem Scaffold weiterhin stabilen Zusammenhalt. Der Effekt von parallel ausgerichteten Poren wurde in vitro an humanen AdMSCs untersucht, indem die Zellproliferation, Morphologie und Expression evaluiert wurde. Wir fanden dabei heraus, dass das Zytoskelett der Zellen in die Richtung der darunterliegenden Poren ausgerichtet war (Abb. 2), was darauf hinweist, dass die Ausrichtung der Poren die Zellmorphologie signifikant beeinflusst. Darüber hinaus änderte sich die Expression der Genmarker für Bänder, Enthese und Knorpel in den Scaffolds, abhängig von der Ausrichtung der Poren. Spezifische Marker für Bänder (Scx) waren in den parallel ausgerichteten Poren höher exprimiert, während spezifische Marker für Knorpel (Sox9) in den zufällig verteilten Poren höher exprimiert waren. Im Vergleich dazu erreichten die Expressionslevels im Übergang zwischen den Phasen mittlere Werte. Diese Ergebnisse ermöglichen neue Einblicke in die Substrattopographie von humanen AdMSCs und legen nahe, dass unsere biphasischen Scaffolds aus Seidenfibroin einen vielversprechenden Ansatz für die Regeneration des Band-Knochen Übergangs darstellen.

Zusätzlich zur Topographie der Scaffolds wird die Versorgung mit Wachstumsfaktoren als Strategie beschrieben, mit der das Zellschicksal beeinflusst werden kann. Besonders die Wachstumsfaktoren der Transforming Growth Factor Beta (TGF-β) Familie (inklusive TGFβ 1-3 und Bone Morphogenetic Protein (BMP) 1-15) werden hinsichtlich ihrer Potenziale in der muskuloskelettalen Regenration erforscht, da sie eine Schlüsselrolle in der Entwicklung des Skeletts einnehmen. Wir haben den Einfluss spezifischer Kombinationen von Wachstumsfaktoren auf die chondrogene und ostegene Differenzierung von AdMSCs in vitro analysiert, indem wir das Zellkulturmedium direkt mit Wachstumsfaktoren versetzt haben. Erste Ergebnisse zeigen, dass TGFβ1 in Kombination mit BMP2 und Parathyroid Hormone related Protein (PTHrP) die Differenzierung von AdMSCs in chondrogene Richtung induzieren kann, aber nicht in der Lage ist, eine Hypertrophie zu verhindern. Letzteres ist ein gängiges Problem nach der Chondrogenese in vitro. Derzeit analysieren wir den Effekt von TGFβ3 in Kombination mit BMP6 und PTHrP auf die chondrogene Differenzierung von menschlichen AdMSCs. Diese Ergebnisse werden Einblicke in die Effekte einer gleichzeitigen und/oder sequentiellen Zufuhr von Kombinationen spezifischer Wachstumsfaktoren auf das Zellschicksal von AdMSCs ermöglichen.